使用大肠杆菌表达全长重组抗体

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华人抗体协会2023年年会，将于2023年5月14日（周日）在美国马萨诸塞州剑桥市(cambRidge, Ma)召开，年会主题为：POST cOVID-19 Pandemic: new FRontieRs and OppoRtunITies of antibody-based BIologics。详情参见：。

近几十年来，基于抗体的生物治疗药已成为最成功的一类生物药物之一。从1986年首次批准抗体药物开始，现在已经有超过 100 种上市抗体。这些治疗性抗体中的⼤多数是在哺乳动物细胞系（例如cHO）中产⽣的，但也存在⼀些抗体⽚段使用⼤肠杆菌(E. coli)表达。

单克隆抗体是可溶性蛋白，大小约为150 kDa，由终末分化的B细胞分泌。每个mab分子由两条相同的重链 (Hc) 和两条相同的轻链 (Lc) 组成，每个 Hc 具有一个可变区 (VH) 和三个恒定区 (cH1–cH3)，每个Lc 具有一个可变区 (VL) 和一个恒定 (cL) 结构域。四个链通过形成分子间二硫键组装，产生具有三个功能单元的四聚体蛋白——两个抗原结合片段 (Fab) 结构域和一个Fc结构域。这些结构特征需要复杂的折叠装置，以及用于形成二硫键的氧化环境。此外，免疫细胞受体需要在Hc的天冬酰胺 (asn, n) 残基处进行糖基化以实现各种效应子功能。

除了抗体的Fc介导的效应子功能外，糖基化被认为是改善抗体的生物物理特性和血清稳定性所必需的结构。然而，根据报道，使用哺乳动物细胞系和大肠杆菌分别制备糖基化抗体与非糖基化抗体，除效应子功能外，糖基化抗体与非糖基化抗体在体外和体内都表现出几乎相同的特性，甚至包括血清半衰期 (t1/2) [1]。因此，如效应子功能不需要或者起反效果，非糖基化抗体可能成为治疗抗体的主要形式。

在1980年代，大肠杆菌是生产第一代生物制药的首选宿主。美国/欧盟目前有超过85种批准的使用大肠杆菌生产的蛋白质疗法，包括超过 25 种重组激素、超过15种重组细胞因子、5种重组酶和7种抗体片段。与大多数其他生产宿主相比，大肠杆菌具有独特的优势，比如快速生产、生产成本低、通用的基因操作、发酵工艺开发简单等等。但是，由于大肠杆菌宿主缺乏复杂的翻译后修饰来生产复杂生物制剂（如mab），哺乳动物细胞系（例如cHO）成为了首选宿主。虽然目前的哺乳动物细胞系生产存在种种缺点，如生产过程昂贵、时间长以及需要病毒清除研究和工艺。

虽然最初大肠杆菌不是生产全长抗体的合适宿主，但它是抗体片段的首选宿主。目前，市场上有七种已获批准的基于抗体片段的疗法（表 1）。

表 1 已获得美国 FDa 批准、使用大肠杆菌生产的单克隆抗体片段[2]

在哺乳动物细胞系生产时，重组蛋白通常被分泌到培养基中。但在大肠杆菌中，重组蛋白或在细胞质中表达，或靶向周质空间，或分泌到培养基中。开发者可以根据目标蛋白特点，结合大肠杆菌每个细胞区室独特的特性，做出将重组蛋白质导向何处的设计和决策。在还原环境的细胞质中，蛋白质可以用可溶形式或包涵体的形式产生。包涵体可以重新溶解并重新折叠成具有功能的形式。如果需要形成二硫键的蛋白质，可以以可溶的活性形式分泌到具有氧化环境的周质隔室中。在某些情况下，蛋白质也可以分泌到培养基中以便于下游纯化。

图 1 大肠杆菌特有的抗体表达区室选择[2]

大肠杆菌周质生产全长免疫球蛋白

全长免疫球蛋白（FL-IgG）在大肠杆菌中的表达最早见于1984年发表的两项研究，研究人员在细胞质中将这些分子表达为包涵体，然后进行增溶和重折叠，但产物的抗原结合活性很低。随后，研究人员注意力从还原细胞质区室转移到氧化性周质区室，2002 年首次报道了具功能的FL-IgG表达。Simmons等报道了在10L生物反应器中表达IgG1，72小时后表达水平高达~150mg/L[3]。Reilly和YansuRa在高细胞密度发酵罐中实现了约1.3 g/L的 IgG1滴度[4]。这类的研究近来很多报道，总体而言，这类方式依赖于轻重链的小心配比，启动子和信号肽设计。

大肠杆菌细胞质生产全长免疫球蛋白

大肠杆菌周质有体积小、内膜转运、外膜渗漏以及缺乏依赖性折叠伴侣等等问题存在，使得其可能不是高水平生产重组蛋白（包括 FL-IgG）的最佳区域。由于这些原因，Genentech和 Celltech分别于 1984 年报告了在大肠杆菌细胞质内表达 FL-IgG 和 FL-IgM 抗体的前两次尝试[5,6]。在这些报告中，蛋白质以包涵体形式累积，在下游重新溶解并重新折叠以实现抗原结合活性。不溶性部分中的这种积累是由于细胞质的还原氧化还原环境导致其在胞内无法形成稳定的二硫键。随后文献报道了专注于优化包涵体的IgG重折叠，如在摇瓶培养中实现了高达50 mg/L的产量，纯度>90%[7]。

大肠杆菌半氧化细胞质生产全长免疫球蛋白

如前所述，在大肠杆菌细胞质中以可溶性和功能性形式表达 FL-IgG 的主要障碍是由于还原环境无法形成稳定且正确配对的二硫键。为了克服这一局限性，研究人员设计了大肠杆菌菌株，使其在细胞质中具有更强的氧化环境，从而能够生产二硫键结合的蛋白质。在细胞质中有两条还原途径——硫氧还蛋白和谷氧还蛋白途径——可以减少二硫键。工程化的大肠杆菌可以通过删除相应的还原酶基因来去除这两条途径，如ORigami™，SHuffle® 等等。

2015年，RoBInson等报告了在SHuffle® 菌株中的首次成功细胞质表达二硫键配位正确的FL-IgG，在摇瓶培养中实现了大约 1~25 mg/L的滴度[8]。

总结

在过去15年中，在大肠杆菌的细胞质和周质区室生产全长抗体方面取得了重大进展。这些改进最初包括优化抗体表达质粒设计，分子伴侣共表达和工程化菌株等等。最近，抗体已经在半氧化的SHuffle®细胞质中产生为可溶性蛋白质，无需复性和重新折叠。目前，SutRo BIophaRma正在进行积极的临床试验，其中有四种非糖基化由大肠杆菌生产的单抗、双抗和aDc，并且已经观察到非常令人鼓舞的临床疗效。鉴于大肠杆菌生产抗体的许多优点（生产快速且经济、低糖异质性），预计未来会有更多此类分子进入临床研究。

RefeRences

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[1] alsenAIdy Ma,Kim JH,MajumdaR R,Weis DD,JosHi SB,TolbeRt TJ,Middaugh cR,Volkin DB.High-thRoughput BIophysical analysis and data visualization of confoRmational staBIlITy of an IgG1 monoclonal antibody afteR deglycosylation. J PhaRm Sci.2013;102(11):3942–56. doi:10.1002/jps.23730.

[2] RasHid, M. H. (2022, DecembeR). Full-length RecomBInant antibodies fRom EscheRicHia coli: pRoduction, chaRacteRization, effectoR function (Fc) engineeRing, and clinical evaluation. In Mabs(Vol. 14, no. 1, p. 2111748). TayloR & FRancis.

[3] Simmons Lc,Reilly D,Klimowski L,Raju TS,Meng G,Sims P,Hong K,SHields RL,Damico La,RancatoRe P, et al.EXPRession of full-length immunoglobulins in EscheRicHia coli: Rapid and efficient pRoduction of aglycosylated antibodies. J Immunol Methods.2002;263(1–2):133–47. doi:10.1016/S0022-1759(02)00036-4.

[4] Reilly DE,YansuRa DG.PRoduction of monoclonal antibodies in E. coli. In:SHiRe SJ,GombOTz W,Bechtold-PeteRs K,andya J, edIToRs. cuRRent tRends in monoclonal antibody development and manufactuRing.new YoRk, USa, nY:SpRingeR;2010. p.295–308. doi:10.1007/978-0-387-76643-0_17

[5] Boss Ma,Kenten JH,Wood cR,Emtage JS.assembly of functional antibodies fRom immunoglobulin heavy and light chAIns synthesised in E. coli. nucleic acids Res.1984;12(9):3791–806. doi:10.1093/naR/12.9.3791.

[6] caBIlly S,Riggs aD,Pande H,SHively JE,Holmes WE,Rey M,PeRRy LJ,Wetzel R,HeynekeR HL.GeneRation of antibody actIVITy fRom immunoglobulin polypeptide chAIns pRoduced in EscheRicHia coli. PRoc natl acad Sci U S a.1984;81(11):3273–77. doi:10.1073/pnas.81.11.3273.

[7] Hakim R,BenhaR I.‘Inclonals’: igGs and IgG-enzyme fusion pROTeins pRoduced in an EscheRicHia coli eXPRession–Refolding system. mabs.2009;1(3):281–87. doi:10.4161/mabs.1.3.8492

[8] RoBInson MP,Ke n,Lobstein J,PeteRson c,Szkodny a,Mansell TJ,Tuckey c,Riggs PD,colussi Pa,noRen cJ, et al.Efficient eXPRession of full-length antibodies in the cytoplasm of engineeRed bacteRia. nat commun.2015;6(1):8072. doi:10.1038/ncomms9072.

关于华人抗体协会

华人抗体协会是一个非营利、非政府的公益性组织，是第一个也是目前唯一一个全球性华人抗体专业组织。协会侧重关注治疗性抗体，并致力于创建一个全球性平台，以促进在治疗性抗体研发，生产以及商业化等领域的合作与交流。关于协会更多介绍请参阅：

华人抗体协会与牛津大学出版社合作，出版发行同行评审英文专业期刊: antibody TheRapeutics。

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